脂肪酸去饱和酶代表一类氧依赖性酶，正在脂肪酸差别场所引入双键，将饱和脂肪酸降饱和为不饱和脂肪酸，催化脱饱和响应，从而出现单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。动作脂肪酸合成途径中的合节酶加入脂肪酸的合成，对微生物脂肪酸双键场所、布局、数目出现特异性影响，不仅可能减少脂肪酸的不饱和度，另有利于鞭策脂质蕴蓄堆集，对庇护生物膜寻常布局和效用拥有紧要旨趣。筹议解说，不管是单表达依旧共表达去饱和酶基因，都可正在必然水平上升高微生物的油脂含量、改革其饱和、不饱和脂肪酸的构成比例。

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HB1310是1 株已报道的高产油核桃内生菌，饱和酶是该菌株脂肪酸合成途径中的合节酶之一，安徽工程大学的叶景、徐思远、张琴*等人将克隆其去饱和酶基因de1、de2，告竣这两种基因正在i BL21（DE3）中的单表达与共表达，探究去饱和酶基因过表达对E.coli油脂产量及其脂肪酸组分的影响，得到高效的产油工程菌，以期为高产油工程菌的拓荒和利用供应技艺维持。

　　采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对 de1、 de2、 de基因的PCR扩增产品举行检测，结果如图1所示。从电泳图可看出，3 个基因的PCR扩增产品碱基长度约1 036、822、1 856 bp，与预期对象条带巨细相符，解说这些基因片断扩增凯旋食品。

　　重组表达质粒pET-28a-de1、pET-28a-de2、pET-28a-de抽提纯化，分袂采用限度性内切酶EcoR I/Xho I、BamH I/Xho I食品、BamH I/Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，各重组表达质粒酶切后均出现两条带（图2），个中大片断均与质粒pET-28a单酶切片断长度同等，幼片断分袂与de1、de2、de基因的宗旨片断长度同等，进一步测序结果表明3 个基因的重组表达质粒均构修凯旋。

　　将重组质粒转化至BL21（DE3）取得工程菌株BL21（DE3）/pET-de1（DE1），BL21（DE3）/pET-de2（DE2）及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de（DE），对工程菌株举行PCR检测、质粒及酶切验证，序列比对结果显示工程菌构修凯旋。

　　3 工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达产品的SDS-PAGE阐发

　　对工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达的酶卵白举行SDS-PAGE检测，结果见图3。与 E. coli BL21（DE3）的卵白SDS-PAGE结果举行比照阐发，挖掘工程菌株DE1、DE2的重组酶正在分子质料约40、32 kDa掌握的条带分袂较 E.coli BL21（DE3）显著加深，与表面分子质料较逼近（DE1的为39.8 kDaPG电子官网，DE2的为31.8 kDa）。结果解说，去饱和酶基因 de1 、 de2 正在 E.coli BL21（DE3）中告竣了高效单表达和共表达食品。

　　对工程菌株DE1、DE2、DE培植6 0 h内的OD 600nm 举行监测，其孕育弧线 h掌握达孕育峰值，其后孕育趋于安靖。从培植历程的孕育弧线 株菌株展现与野生菌株相似的孕育弧线，解释表源的去饱和酶基因 de1 、 de2 单表达和共表达历程中，工程菌株仍能庇护有用的孕育。然而，24～60 h，工程菌株的孕育均略低于野生菌株，能够因为表源基因表达历程中，插入新的酶会形成合成代谢扰乱内源性代谢食品，合成代谢和内源性代谢之间的比赛导致代谢职守，从而导致宿主的应激响应和心理转折，惹起工程菌株孕育量的低落。

　　红四氮唑动作一种氧化剂，可能从去饱和酶承担电子，后自己从无色被还原为血色的甲攒，从而可能表征细胞内去饱和酶活性。工程菌株和野生菌株60 h内的酶活性转折弧线、DE的去饱和酶活性正在60 h诱导历程中均高于野生菌株，尤以24 h的酶活性最高，分袂为同岁月野生菌株的1.38、1.48 倍和1.75 倍，解说去饱和酶基因 de1 、 de2 正在24 h内即告竣了高水准的表达；24 h后工程菌株酶活性呈低落趋向，能够是因为表源基因的过表达导致 E.co li 中造成多量的原宥体。而发酵后期跟着养分物质花费以及细菌孕育进入衰弱期 ，去饱和酶活性趋于稳固，但仍略高于或与野生菌株的酶活性逼近。

　　6 去饱和酶基因de1、de2单表达和共表达对油脂产量及脂肪酸组分的影响

　　为最大水平排斥能够因为原宥体的造成导致片面菌株去饱和酶活性低落，而形成后续实践对细菌脂肪酸产量及脂肪酸构成因素的实践过失食品，本筹议仅收罗了工程菌株和野生菌株发酵24 h的菌体样品举行细菌油脂的提取及其脂肪酸组分阐发。

　　如图6所示，去饱和酶基因的表达有用加强了细菌脂质的蕴蓄堆集，与野生菌株比拟，工程菌株的油脂产量和质料分数均明显升高。DE1、DE2、DE的油脂产量分袂可达0.57、0.58、0.72 g/L，均较野生菌株升高83%以上，而油脂质料分数从野生菌的9.45%升高至18.44%以上，分袂较野生菌株升高97.78%、95.17%、135.09%。总的来看，去饱和酶基因 de1 与 de 2 共表达对油脂产量和含量升高的鞭策功用明显优于这两个基因单表达的，这与Yan Fengxin等正在解脂耶氏酵母表达Δ12和Δ15去饱和酶基因鞭策脂质蕴蓄堆集效率更明显的结论同等食品。

　　将提取的细菌油脂举行甲酯化后，行使气相色谱对脂肪酸组分举行定性和定量阐发。基于37 种脂肪酸甲酯混标对油脂样品举行阔别定性，比照模范品参考图谱得出各组分的出峰时光，采用十五烷酸甲酯动作内标对脂肪酸甲酯举行定量阐发。菌株脂肪酸组分及其质料分数见表3。

　　表3显示，E.coli BL21（DE3）的油脂脂肪酸组分以棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）为主，其次为豆蔻酸（C14:0）、亚油酸（C18:2）。3 株工程菌中油脂脂肪酸仍以上述4 个组分为主，但各组分的质料分数却发作了显著的转折。个中PG电子官网，C8:0、C15:1、C18:0脂肪酸质料分数均高于野生菌株，越发是工程菌株DE1、DE中的不饱和脂肪酸组分C15:1、C18:2、C22:2质料分数均明显高于野生菌株。为揭示去饱和酶基因de1、de2单表达及共表达对油脂脂肪酸组分的影响，统计了工程菌株DE1、DE2食品、DE有关于野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸的升高量。如图7所示，工程菌株中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量均升高，饱和脂肪酸含量分袂升高72.26%、66.93%、123.21%，不饱和脂肪酸含量分袂升高112.18%、44.18%、134.30%，解说去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改革。

　　表面上，去饱和酶特异性地鞭策成熟脂肪酸中顺式双键的造成，将饱和状况下的脂肪酸去饱和，合节布局域和合节位点组成去饱和酶的活性核心并影响其活性，且差另表催化底物对催化速度也出现必然的影响。有筹议解说，脂肪酸去饱和酶的类型PG电子官网、表达水准和活性定夺了不饱和脂肪酸的定性和定量构成，格表去饱和酶的过表达可能鞭策细胞内单不饱和脂肪酸的富集和脂质蕴蓄堆集，从而到达改革脂肪酸组分的效率。本筹议通过对工程菌株有关于野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸含量的升高量举行统计阐发，阐清楚去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改革，越发是不饱和脂肪酸含量的升高。表4总结了近年来酵母菌和E.coli中过表达去饱和酶基因惹起菌株不饱和脂肪酸组分和含量转折的筹议结果，可见去饱和酶关于脂肪酸组分的改革至合紧要，过表达差别泉源的去饱和酶基因关于高产油工程菌或格表组分工程菌的构修拥有紧要利用代价和表面旨趣。

　　正在E.coli BL21（DE3）中表达了来自产油核桃内生菌B.subtilis HB1310的去饱和酶基因，构修了单基因表达菌株BL21（DE3）/pET-de1、BL21（DE3）/pET-de2及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de，告竣了去饱和酶基因的高表达，有用鞭策了E.coli去饱和酶活性的升高，使脂肪酸蕴蓄堆集量得以减少，升高了菌株油脂产量和含量，改革了脂肪酸组分，越发使不饱和脂肪酸含量明显升高。本筹议可为产油脂工程菌的拓荒和利用供应有代价的菌种泉源，对高效产油工程菌的构修拥有必然的利用代价。

　　本文《过表达去饱和酶基因对大肠杆菌脂肪酸合成的影响》泉源于《食物科学》2023年45卷第2期72-78页，作家：叶 景，许思远，张 琴，钱 程，曹娟娟，赵 沛。DOI:10.7506/spkx0509-076。点击下方 阅读原文即可查看著作合连音信。

　　演习编纂：天津贸易大学生物技艺与食物科学学院 梁雯菁；负担编纂：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片泉源于著作原文及摄图网。

　　为了帮帮食物及生物学科科技职员驾御英文科技论文的撰写技艺、升高SCI期刊收录的掷中率，归纳晋升我国食物及生物学科科技职员的高质料科技论文写作才华。《食物科学》编纂部拟定于2024年8月1—2日正在武汉举办“第11届食物与生物学科高水准SCI论文撰写与投稿技艺研修班”，为期两天。

　　为升高我国食物养分与平和科技自立改进和食物科技资产维持才华，鞭策食物资产升级，帮力‘康健中国’战术，北京食物科学筹议院、中国食物杂志社、国际谷物科技学会（ICC）将与湖北省食物科学技艺学会、华中农业大学、武汉轻工大学、湖北工业大学、中国农业科学院油料作物筹议所、中南民族大学、湖北省农业科学院农产物加工与核农技艺筹议所、湖北民族大学、江汉大学、湖北工程学院、果蔬加工与品德调控湖北省要点实践室、武汉食物化妆品检讨所、国度墟市监禁实践室（食用油质料与平和）、处境食物学教诲部要点实践室协同举办“第五届食物科学与人类康健国际研讨会”。聚会时光：2024年8月3—4日，聚会所在：中国 湖北 武汉。

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